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中文標題：METTL3介導的LncRNA EN_42575 m6A修飾減輕了CPB2毒素誘導的IPEC-J2細胞損傷

發(fā)表期刊：International Journal of Molecular Sciences

中科院分區(qū)：2區(qū)

影響因子：5.6

發(fā)表時間：2023年3月

合作單位：甘肅農(nóng)業(yè)大學

運用技術：RNA pull down MS（由輝駿生物提供技術支持，點擊查看服務詳情）

● 研究背景

m6A修飾是真核生物中最豐富的RNA修飾，受多種酶類的調控，其中METTL3、METTL14和WTAP可形成復合體，是m6A甲基化酶的核心組分。C型產(chǎn)氣莢膜梭菌侵襲性強，可感染家畜和人類，引起壞死性腸炎，產(chǎn)氣莢膜梭菌β2 (CPB2)毒素是該菌的主要毒力因子。研究者之前已構建了C型產(chǎn)氣莢膜菌仔豬腹瀉體外細胞模型，并RNA免疫沉淀測序(MeRIP-seq)實驗發(fā)現(xiàn)lncRNA EN_42575的甲基化水平和表達水平因CPB2毒素處理而顯著降低。本項目進一步闡述了lncRNA EN_42575的m6A修飾在該過程中的作用，為探討仔豬感染性腹瀉的表觀遺傳學觀點提供了理論依據(jù)。

● 研究結果

1. LncRNA EN_42575的表達模式分析

為了評估CPB2毒素處理對lncRNA EN_42575表達的影響，研究者每12 h檢測CPB2毒素培養(yǎng)的豬小腸上皮細胞（IPEC-J2）中的LncRNA EN_42575表達，發(fā)現(xiàn)CPB2毒素處理可以顯著降低lncRNA EN_42575的表達，處理24h達到最低值（圖1A）。細胞核/質分離和RNA-FISH分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA EN_42575定位于細胞質中（圖1B,C）。這些結果表明lncRNA EN_42575在產(chǎn)氣莢膜梭菌C型誘導的豬腹瀉中起到了一定作用。

  圖1

2. LncRNA EN_42575減輕CPB2誘導的細胞毒性，促進細胞增殖                                                                              

接著，研究者分別構建了過表達和干擾lncRNA EN_42575的IPEC-J2細胞株（圖2A），用以分析lncRNA EN_42575在CPB2誘導的細胞毒性中的作用。細胞培養(yǎng)上清液中的乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測用于細胞損傷程度，結果顯示CPB2處理引起LDH活性顯著增加，而lncRNA EN_42575的表達水平與LDH活性成反相關，表明lncRNA EN _42575可以抑制細胞毒性（圖2B）。CCK-8和EDU檢測表明，CPB2處理顯著降低了IPEC-J2細胞的活力和增殖能力，而lncRNA EN_42575過表達逆轉了這一結果，lncRNA EN_42575干擾進一步抑制了細胞活力和增殖能力（圖2C-E）。

圖2

3. LncRNA EN_42575抑制CPB2誘導的細胞凋亡和氧化損傷

在細胞凋亡反應中，線粒體膜電位(ΔΨm)會降低，因此研究者用JC-1線粒體膜電位探針來檢測LncRNA EN_42575對CPB2誘導的細胞凋亡的影響。CPB2毒素處理后，JC-1熒光從紅色變?yōu)榫G色，表明ΔΨm降低，凋亡增加。lncRNA EN_42575過表達導致綠色熒光減少，干擾后綠色熒光進一步增加（圖3A）。lncRNA EN_42575過表達顯著抑制了凋亡調節(jié)因子Bax的表達，促進了Bcl-2的表達，而lncRNA EN _42575干擾有相反趨勢（圖3B，C）。之后，研究者用熒光探針DCFHDA檢測細胞中的活性氧（ROS），CPB2處理顯著增加了綠色熒光，表明ROS水平升高，LncRNA EN_42575過表達降低了ROS水平，而干擾促進了ROS的升高（圖3D）。這些結果說明lncRNA EN_42575可以抑制IPEC-J2細胞凋亡并減輕CPB2毒素誘導的氧化損傷。

圖3

4. LncRNA EN_42575是METTL3的靶標

研究者使用Integrative Genomics Viewer軟件對以往的MeRIP-seq項目數(shù)據(jù)進行了可視化分析，發(fā)現(xiàn)CPB2毒素處理導致兩個高富集的特異性m6A峰消失了（圖4A）。MeRIP-qPCR實驗也證實CPB2處理顯著降低了lncRNA EN_42575的m6A甲基化水平（圖4B）。為了研究甲基化相關酶對lncRNA EN_42575的調控，分別過表達和敲低了METTL3（圖4C），發(fā)現(xiàn)其水平與lncRNA EN_42575成正相關（圖4D）。為了確定lncRNA EN_42575的m6A修飾對METTL3介導的基因調控的重要性，研究者構建了lncRNA EN_42575野生型和突變型(A到T)載體（圖4E），并進行了雙熒光素酶實驗。結果顯示，野生型METTL3顯著增加了野生型lncRNA EN_42575的熒光素酶活性，不能增加突變型lncRNA EN_42575的熒光素酶活性；突變型METTL3與對照相比沒有變化（圖4F）。此外，在用放線菌素D阻斷細胞RNA合成后，抑制METTL3的表達顯著降低了lncRNA EN_42575的半衰期（t1/2）（圖4G）。這些結果表明，METTL3通過m6A甲基化調控lncRNA EN_42575的表達。

圖4

5. lncRNA EN_42575靶基因的功能分析

為了確定lncRNA EN_42575在CPB2誘導的IPEC-J2細胞中的功能。研究者采用RNA pull down MS技術來尋找能夠與lncRNA EN_42575結合的蛋白質。對質譜（LC-MS/MS）鑒定到的70個潛在結合蛋白的GO功能和KEGG通路分析顯示，它們參與了凋亡、沙門氏菌感染、癌癥通路和冠狀病毒病（新冠肺炎）等相關通路（圖5B）。

圖5

● 結論

本項目在前期MeRIP-seq實驗的基礎上，在仔豬感染性腹瀉細胞模型中，進一步闡明了METTL3酶通過m6A甲基化調控lncRNA EN_42575的表達，進而抑制了CPB2誘導的細胞凋亡和氧化損傷，促進細胞增殖。

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